質粒DNA中量提取試劑盒
（離心柱型）
|
試劑盒內容 |
10次 貨號cat:FP000 |
50次貨號cat:FP090 |
|
RNaseA (10mg/ml) |
300ul×5 |
300ul×25 |
|
溶液S1 Resuspension Buffer |
125 ml |
125 ml×5 |
|
溶液S2 Lysis Buffer |
125ml |
125 ml×5 |
|
溶液S3 Neutralization Buffer |
45ml |
45 ml×5 |
|
樹脂溶液 （Matrix） |
125 ml |
125×5 |
|
漂洗緩沖液W1 Wash Buffer W1 |
75 ml |
75 ml×5 |
|
漂洗緩沖液W2 Wash Buffer W2 |
30 ml |
30 ml×5 |
|
洗脫緩沖液 Elution Buffer |
15 ml |
145ml×5 |
|
過濾柱 Filter Column |
10 |
50 |
|
吸附柱 Spin Column |
10 |
50 |
|
收集管 Collection Tube(50ml) |
20 |
100 |
|
說明書 Specification |
1 |
1 |
貯存條件：
室溫，有效期一年。溶液S1加入RNase后2-8℃保存
產品簡介
※ 本公司與由美國公司通力合作，由美方公司提供全方面技術、關鍵純化材料，，將核酸純化等系列產品，在國內推廣，實現了進口產品本土化生產。每種產品通過嚴格的技術把關，已達到進口產品的品質，而價格上卻是國產試劑盒的價位。
※ 本試劑盒采用經典的SDS堿裂解法裂解細胞，離心吸附柱內的硅膠膜和樹脂在高鹽低pH值狀態下選擇性地結合溶液中的質粒DNA，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質和其它細菌成分去除，最后低鹽，高pH值的洗脫緩沖液將純凈質粒DNA從硅膠膜和樹脂上洗脫。
※ 采用進口硅膠膜和樹脂，吸附量大，產率高，實驗結果可重復性好。
※ 溶液中添加了作用指示劑，使每一步作用程度一目了然。
※ 不需要使用有毒的苯酚，氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀。
※ 溶液S1，加入了特定酶穩定劑，加入RNase A后， 4℃保存至少一年不會失活。
※ 快速、方便，從250～500 ml大腸桿菌LB（Luria Bertani）培養液中，可快速提取500～1000ug純凈的高拷貝質粒DNA，提取率達85～90%。
※ 獲得的質粒產量高，超螺旋比例高、純度好。直接可以用于酶切、轉化、PCR、體外轉錄、測序等各種分子生物學實驗。
操作步驟：
1.試驗前準備及注意事項
a. 溶液S1 Resuspension Buffer 使用前將RNase A全部加入（使用前離心），均勻混合后4℃保存并標示。
b. Wash Buffer W1和Wash BufferW2 使用前請按標簽加入無水乙醇并標示。
c. 使用前檢查溶液S2、溶液S3各試劑是否有沉淀，若有請于37℃或微波爐稍加熱溶解。S2可以在手握不燙手時使用，S3室溫使用。
d. 溶液S2 Lysis Buffer及溶液S3用后蓋緊瓶蓋。
2. 收菌 取150～250ml 在LB 培養基中培養過夜的高拷貝數質粒菌液，或500 ml 過夜培養的低拷貝質粒/Cosmid菌液（若使用豐富培養基，菌液體積應減半或更少），≥3,000×g 離心10 min，棄上清。將離心管倒置于紙巾上數分鐘，除盡上清。
3. 重懸菌液 加10 ml Buffer S1 懸浮細菌沉淀，懸浮需均勻，不應留有小的菌塊。
* 確認Buffer S1 中已加入RNase A。請充分重懸細菌，若不充分會導致堿裂解不完全。
4. 堿裂解 加10 ml Buffer S2，溫和并充分地上下翻轉8-10 次混合均勻使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液。
* Buffer S2 使用后立即蓋緊瓶蓋，以免空氣中的CO2 中和Buffer S2 中的NaOH，降低溶菌效率。
* 避免劇烈搖晃，否則將導致基因組DNA 的污染。
* 此步驟不宜超過5 min。
* 加Buffer S2 后裂解液會變成藍色，充分混勻以保證形成均一的藍色溶液。
5. 中和 加4ml的Buffer S3，溫和并充分地上下翻轉10-12 次混合均勻，直至形成緊實的凝集塊，室溫放置5 min。
* 加入Buffer S3 后應立即混合，以避免形成局部的凝結塊。
* 避免劇烈搖晃，否則將導致基因組DNA 的污染。
* 加Buffer S3 后藍色會消失，充分混勻以保證懸浮物中藍色均消失。
6. 過濾 10,000×g 離心10 min。將上清全部轉入過濾柱，10,000×g 離心（4°C）2 min，如過濾不完全，可以適當延長離心時間。
7. 加入樹脂 用力振蕩樹脂膠液，使得樹脂完全懸浮均勻。加入約12 ml樹脂溶液，混勻。
8. 柱結合 將上述操作的混合樹脂溶液，分批全部轉入轉移至吸附柱中，10,000×g 離心2 min，如過濾不完全，可以適當延長離心棄濾液。
9. 漂洗 將13ml的Wash Buffer W1 加入吸附柱中，10,000×g 離心（4°C）2 min,棄濾液。
10. 再漂洗 將13ml的Wash Buffer W1 加入吸附柱中，10,000×g 離心（4°C）2 min,棄濾液。 空柱10,000×g 離心（4°C）2 min，除去殘留乙醇。
11. 洗脫 將大量制備管置于潔凈的50 ml 離心管中，在制備管的膜中央上加1.5 ml Elution Buffer 或pH8.5去離子水，室溫 靜置5 min�！�6,000×g 離心5 min 收集質粒DNA。
注意：Elution Buffer 組成為2.5mM Tris-HCI (pH8.5),不影響測序和酶切反應，。把水或洗脫液加熱于65℃使用時有利于提高洗脫液效率，如果提取的質粒>10kb，請將洗脫液預熱至65℃，并適當延長洗脫時間。
質粒DNA濃度和純度檢測
OD260值為1，相當于50ug/ml的雙鏈DNA。也可以通過DNA Marker通過瓊脂糖凝膠電泳半定量。
OD260/ OD280比值一般為1.7-1.8，如果洗脫時不使用緩沖液，而使用去離子水，由于受PH值和離子濃度的影響，比值會偏低。
| 
