超純質粒DNA小量提取試劑盒

產品簡介     

※  本試劑盒采用經典的SDS堿裂解法裂解細胞，離心吸附柱內的硅膠膜在高鹽低pH值狀態下選擇性地結合溶液中的質粒DNA，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質和其它細菌成分去除，最后低鹽，高pH值的洗脫緩沖液將純凈質粒DNA從硅膠膜上洗脫。

  ※  具有高效率的內毒素去除液，有效去內毒素，經檢測，一次分離即符合國家藥典內毒素含量標準。非常適合轉染、轉化及動物免疫及各種分子生物學實驗。

  ※  快速、方便，從1～5 ml大腸桿菌LB（Luria Bertani）培養液中，可快速提取15-40ug純凈的高拷貝質粒DNA，提取率達85～90%。

操作步驟：

1.試驗前準備及注意事項

 a. 溶液S1 Resuspension Buffer 使用前將RNase A全部加入（使用前離心），均勻混合后4℃保存并標示。

     b. Wash Buffer 使用前請按標簽加入無水乙醇并標示。

     c. 使用前檢查溶液S2，若有請于37℃或微波爐稍加熱溶解。S2可以在手握不燙手時使用。

     d. 溶液S2 Lysis Buffer、Buffer S4及洗脫液用后擰緊瓶蓋。

     e. 產品具有腐蝕性，注意防護。如接觸，請用大量水沖洗并及時就醫。

2.  收菌  取1～5ml過夜培養的菌液，12000rpm離心1分鐘，棄上清。

注意：一般高拷貝質粒用1-3ml菌液，低拷貝質粒用2-10ml菌液。若使用大體積菌液，請相應加大各溶液的體積。

3.  重懸菌液  將250μl溶液S1 Resuspension Buffer(已加RNase A)加入菌液沉淀，Vortex充分懸浮細菌沉淀。

    注意：請充分重懸細菌，若不充分會導致堿裂解不完全。

4.  堿裂解  將250μl溶液S2 Lysis Buffer 加入細菌重懸液，溫和地上下翻

轉混合6～10次，使菌體充分裂解，直至溶液變得清亮。

注意：此步請輕柔混合，劇烈混合如Vortex會導致基因組DNA斷裂，從而污染質粒DNA。

     堿裂解不宜超過5分鐘，否則會導致部分質粒DNA不可逆變性。

5.  中和  加入350μl溶液S3 Neutralization Buffer,立即輕柔地上下翻轉混合直至藍色徹底消失。室溫放置5分鐘后，室溫12000rpm離心10分鐘。

6.  去內毒素：

a..將上述操作的上清液體轉移另一離心管中(忌取到沉淀)，加400μl S4,振蕩混勻，

b.不時振蕩數次每次30秒。

c. 12,000 rpm,30℃離心5 min。

 d. 溶液分為兩相。上層水相含DNA，下層油狀相含內毒素。

e.將含DNA的上層水相轉移到吸附柱Spin Column中，棄層油狀相。寧肯少提上層水相，也不要不要吸到中間層。一般一次抽提就可以符合標準；也可以根據需要重復抽提2次，即重復步驟a-d兩次。

7.  柱結合 12000rpm室溫離心1分鐘，棄濾液。

9.  漂洗  將700μl的Wash Buffer加入吸附柱Spin Column中，12000rpm室溫離心30-60秒，棄濾液。

10. 再漂洗  將700μl的Wash Buffer加入Spin Column中，12000rpm離心30-60秒，棄濾液。 空柱12000rpm再室溫離心2分鐘，除去殘留乙醇。

11. 洗脫  將Spin Column按置于新的潔凈的1.5ml的離心管上，在吸附柱Spin Column樹脂沉淀中央處加入50-100μl的水或洗脫緩沖液Elution Buffer，室溫靜置1分鐘，12000rpm離心1分鐘洗脫DNA，可立即用于下游分子生物學實驗或-20℃保存。

    注意：Elution Buffer 組成為2.5mM Tris-HCI (pH8.5),不影響測序和酶切反應，或以PH8.5的去離子水代替。把水或洗脫液加熱于60℃使用時有利于提高洗脫液效率，如果提取的質粒>10kb，請將洗脫液預熱至60℃，并適當延長洗脫時間。

質粒DNA濃度和純度檢測

   OD260值為1，相當于50ug/ml的雙鏈DNA。也可以通過DNA Marker通過瓊脂糖凝膠電泳半定量。

   OD260/ OD280比值一般為1.7-1.8，如果洗脫時不使用緩沖液，而使用去離子水，由于受PH值和離子濃度的影響，比值會偏低。