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          首頁產品分類目錄分子生物修飾酶→T4 DNA Ligase

          T4 DNA Ligase

    GalaxyBio Code包裝規格價格說明書購物車
    FM01135000U95元
    FM01235000UX5380元

    產品簡介

    T4 DNA Ligase

     

     

     

     

     

    包裝內容

    100次

    Cat:FP015

    500次

    Cat:FP010

    T4 DNA Ligase(350 U/μl)

    35,000 Units

    35,000 UnitsX5

    10×T4 DNA Ligase Buffer

    1 ml

    1ml X5

     

    貯存條件:

    -20℃保存

     

    產品簡介     

    該酶催化相鄰DNA鏈的5’-P末端和3’-OH末端以磷酸二酯鍵結合的反應,需ATP作輔酶。本酶不僅可以催化粘性末端之間或平滑末端之間的DNA的連接,也可以催化DNA與RNA之間以及少數RNA之間的連接,修復雙鏈DNA、RNA、DNA/RNA雜交鏈中的單鏈切口

     

    起源

    Escherichia coli carrying the plasmid that enable highly expression of T4 DNA Ligase gene。

     

    酶貯存溶液:

    10 mM Tris-HCl (pH 7.5),

    0.1 mM EDTA,

    50 mM KCl,

    1 mM DTT,

    50% Glycerol

    and 200 μg/ml Nuclease free BSA.

     

    活性定義

    在20 μl的連接反應體系中,6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反應30分鐘時,有90%以上的DNA片段被連接所需要的酶量定義為1個活性單位(U)。

    本酶的1 U相當于ATP-PPi交換反應中0.008 Weiss Unit。    

     

     

     

     

    1) 2,000 U的本酶和1 μg的λ-Hind III片段在37℃下反應24小時,DNA的電泳譜帶不發生變化。

    2) 2,000 U的本酶和1 μg的Supercoiled pBR322 DNA在37℃下反應24小時,DNA的電泳譜帶不發生變化。

    3) 2,000 U的本酶和1 μg的16S,23S rRNA在37℃下反應24小時,RNA

     

    1)DNA片段和載體DNA的連接。

    2)DNA片段和Linker或Adaptor DNA的連接。

     

    使用注意

    連接反應因末端堿基順序的不同而反應速度各異,一般有下列傾向:

    突出末端:Hind III>Pst I>EcoR I>BamH I>Sal I

    平滑末端:Hae III>Alu I>Hinc II>Sma I

    EcoR V>Sca I>Pvu II>Nru I

    其中連接Hind III末端的速度約為連接Sal I末端速度的10~40倍;

    而連接Hae III末端的速度約為連接Sma I末端速度的5~10倍。

     

    附帶10×Buffer組成(保存:-20℃)

    10×T4 DNA Ligase Buffer

    Tris-HCl(pH 7.6) 660 mM

    MgCl 66 mM

    DTT 100 mM

    ATP 1 mM

    * Buffer在融解時,如果出現少量沉淀屬正,F象,請于37℃保溫溶解后使用

    使用舉例

    DNA片段和載體DNA的連接

    1. 在微量離心管中制備下列連接反應液。

    10×T4 DNA Ligase Buffer          2.5 μl

    DNA片段*                       約0.3 pmol

    載體DNA**                     約0.03 pmol

    T4 DNA Ligase                    1 μl

    dH2O                         up to 25 μl

    * DNA片段的摩爾數應控制在載體DNA摩爾數的3~10倍。

    ** 平滑末端的載體與DNA片段進行連接時,應首先將載體進行去

    磷酸化處理,以防止其自身環化。

    2. 16℃過夜反應。

    3. 加入2.5 μl(1/10量)的3 M CH3COONa(pH5.2)。

    4. 加入62.5 μl(2.5倍量)的冷無水乙醇,-20℃放置30~60分鐘。

    5. 離心回收沉淀,用70%的冷乙醇清洗沉淀,真空干燥。

    6. 25~50 μl TE溶解,10~20 μl轉化至100 μl的感受態細胞中。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     


       

     

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